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O sistema de detecção, com base no método indireto do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC), consiste em adicionar um anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário biotinilado e, finalmente, adicionar o complexo peroxidase-avidina-biotina.
No método peroxidase-antiperoxidase (PAP), o anticorpo primário e o anticorpo terciário devem ser da mesma espécie animal. O anticorpo secundário deverá se ligar especificamente às porções FC dos anticorpos primário e terciário e, necessita, portanto, ser produzido em espécie animal diferente, e, nesse caso, o anticorpo primário poderia ser produzido a partir de um coelho, o secundário, a partir de uma cabra, e o terciário (do reagente PAP) a partir do coelho e contra a molécula de peroxidase (horseradish).