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Qualquer coloração que não é resultado da reação antígeno/anticorpo é denominada de coloração de fundo específica.
A incubação das lâminas em uma câmara úmida é aconselhável em qualquer temperatura, pois, se uma lâmina tratada com o anticorpo primário ficar seca, tem-se como resultado uma coloração de fundo.
O tempo de incubação depende da sensibilidade e concentração do anticorpo primário, bem como da qualidade do tecido.
O pH e a composição química das soluções usadas para recuperação antigênica não são importantes na reação imuno-histoquímica.
Os fixadores coagulantes, como o álcool, e aqueles de ligação cruzada, como o formaldeído, podem causar alterações na configuração de proteínas, mascarando os determinantes antigênicos e, consequentemente, afetando a ligação do anticorpo.